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點擊次數:13077 發布時間:2013/9/29 14:28:55
實驗步驟:
1. 取50~100mg的組織,加入1 ml Trizol試劑,用勻漿器打勻(Trizol 先放于冰上)。
2. 將勻漿室溫放置5 min。
3. 加入200 μl 氯仿,劇烈震蕩混勻30s,冰上靜置3min。
4. 12000 rpm,4℃ 離心15 min。
5. 將上清液小心轉移到新的1.5 ml離心管中(取400μl ),加入等量體積的異丙醇,上下顛倒幾次混勻,室溫下放置15 min。(此步中注意:不要吸取任何中間層物質,寧缺勿爛。)
6. 12000 rpm, 4℃ 離心15 min 。
7. 小心移去上清液,防止rna沉淀丟失。
8. 用70%乙醇(DEPC處理的水配制)洗滌1次,加入700 μl乙醇,將RNA沉淀彈起,漂洗。(此時RNA是不溶解的)
9. 8000 rpm,室溫離心10min。
10. 盡可能徹底地吸走上清,防止RNA沉淀丟失。
11. 真空離心干燥3~5分鐘,或放在室溫下使乙醇完全揮發掉。
12. 沉淀用30 μl DEPC-H2O溶解。如發現沉淀難溶,68 ℃處理10 min。
13. RNA檢測
(1)測定樣品在260 nm和280 nm的吸光值按1OD=40 μg/ ml RNA計算RNA的產量。OD260/OD280在1.8-2.0 。
(2)進行甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳,確定RNA的完整性和污染情況。
常見失敗原因:
1、低得率
A.樣品裂解或勻漿處理不徹底
B.*后得到的RNA沉淀未完全溶解
2、A260/A280<1.65
A.檢測吸光度時,RNA樣品不是溶于TE,而
是溶于水。低離子濃度和低pH條件下,A280
值會較高。
B.樣品勻漿時加的試劑量太少。
C.勻漿后樣品未在室溫放置5分鐘。
D.水相中混有有機相。
E.*后得到的RNA沉淀未完全溶解。
3、RNA降解
A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍
B.樣品或提取的RNA沉淀保存于-5--20℃,
未在-60--70℃保存。
C.細胞在胰酶處理時被破壞。
D.溶液或離心管未經RNase去除處理。
原創作者:上海恒遠生物科技有限公司