以下是影響ELISA檢測的關鍵因素，也是眾多ELISA 用戶在實驗中經常遇到的問題及解決方案：
Q1：為什么所有試劑和檢測樣本要平衡至室溫后再進行加樣操作？
A1：溫度是ELISA結合反應的重要影響因素。為了使所有樣本在一致的溫度下反應，實驗前務必將所有試劑平衡至室溫，包括檢測樣本。避免因溫度的動力學反應差異而導致ELISA檢測結果的不準確。
Q2：為什么標準曲線線性較差？
A2：按照推薦方式保存標準品；溶解標準品之前需短暫離心，徹底收集粉末；確保標準品完全溶解和混勻（大約10min），然后再進行后續的系列稀釋步驟，確保每一步都充分混勻且精確移液；顯色的恰當終止；選擇合適的數學擬合方程繪制標準曲線。
Q3：ELISA實驗為什么必須設置復孔？
A3：為獲得更準確的實驗結果，強烈建議標準品及樣本進行復孔檢測。
因為復孔檢測可以：
★計算平均值，確保實驗結果更準確；
★解決實驗中誤操作造成的跳孔現象；
★計算CV值，對實驗的操作和試劑盒的精密度進行評估。
Q4：為什么實驗過程中孵育、洗滌需要振蕩？如何振蕩？
A4：振蕩孵育使反應更充分，振蕩洗滌使背景更干凈。建議使用酶標專用96孔微孔板振蕩器。
孵育過程振蕩，可以加快、加強抗原抗體間的相互碰撞接觸，使得反應過程更加完全，OD值通常會比未振蕩孵育的結果要高；洗滌過程振蕩，可以使洗板更干凈，在很大程度上能降低背景值，同時可以提高試劑盒檢測的靈敏度。 具體操作請參見說明書或致電勁馬生物
Q5：何時終止ELISA反應？
A5：ELISA實驗*終需要酶催化底物顯色反應來完成，在*佳時間終止反應是ELISA實驗成功的重要因素。在HRP-TMB酶反應系統中，當濃度標準品顏色不再變深，倒數2-3個濃度標準品顏色開始有淺藍色時，便需要終止反應；或者也可以根據濃度標準品孔在620nm的OD值來決定，OD620=0.9-0.95之間時即可終止。
Q6：為什么酶標儀讀數時必須選用雙波長？
A6：首先，酶標儀使用前務必預熱10-15min，使測讀結果更穩定。其次，ELISA實驗采用雙波長測定吸光度，可以排除單波長檢測時的測定干擾（標本的濃度，干擾色等）。一般采用波長作為參照波長，在參照波長下，檢測物的吸光值*小，檢測波長和參照波長的吸光值之差可以消除非特異性吸收；因此，雙波長測定，可限度的消除指紋、雜質及不透光的物質對酶標儀讀數帶來的誤差，以保證實驗數據的準確度。
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