細胞破碎技術是指利用外力破壞細胞膜和細胞壁,使細胞內容物包括目的產物成分釋放出來的技術,是分離純化細胞內容合成的非分泌型生化物質(產品)的基礎。結合重組DNA技術和組織培養技術上的重大進展,以認為很難獲得的蛋白質現在可以大規模生產。
目已發展了多種細胞破碎方法,以便適應不同用途和不同類型的細胞壁破碎。 破碎方法可規納為機械法和非機械法兩大類,一起來學習下吧。
機械法:
1.高壓勻漿破碎法(homogenization)
高壓勻漿器是常用的設備,它由可產生高壓的正向排代泵(positive displacenemt pump)和排出閥(discharge valve)組成,排出閥具有狹窄的小孔,其大小可以調節。細胞漿液通過止逆閥進入泵體內,在高壓下迫使其在排出閥的小孔中高速沖出,并射向撞擊環上,由于突然減壓和高速沖擊,使細胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上,可以采用單次通過勻漿器或多次循環通過等方式,也可連續操作。為了控制溫度的升高,可在進口處用干冰調節溫度,使出口溫度調節在20℃左右。在工業規模的細胞破碎中,對于酵母等難破碎的及濃度高或處于生長靜止期的細胞,常采用多次循環的操作方法。
2.振蕩珠擊破碎法 (Skaking Bead)
將等體積的小量組織樣品與高密度的ZircoBeads放入可密封的2ml螺旋蓋微量管中,再加入緩沖液與穩定成份到1.5ml的體積, 用6500RPM振蕩機高速上下振動8,休息8,再振動8即可.此方法是目快且一次可處理多樣品的方法. 一臺機器多可以在一天處理2400支樣品.對小量且多樣的人很方便。
3.高速攪拌珠研磨破碎法(fine grinding)
研磨是常用的一種方法,它將細胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁等研磨劑一起快速攪拌,使細胞獲得破碎。在工業規模的破碎中,常采用高速珠磨機 。
4.超聲波破碎法(ultrasonication)
超聲波破碎法利用超聲波振蕩器發射的15-25kHz的超聲波探頭處理細胞懸浮液。 超聲波振蕩器有不同的類型,常用的為電聲型,它是由發生器和換能器組成,發生器能產生高頻電流,換能器的作用是把電磁振蕩轉換成機械振動。超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質兩種型式,一般破碎效果后者比者好。
非機械法:
1.滲透壓沖擊破碎法(osmotic shock)
滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法,將細胞放在高滲透壓的溶液中(如一定濃度的甘油或蔗糖溶液),由于滲透壓的作用,細胞內水分便向外滲出,細胞發生收縮,當達到平衡后,將介質快速稀釋,或將細胞轉入水或緩沖液中,由于滲透壓的突然變化,胞外的水迅速滲入胞內,引起細胞快速膨脹而破裂。
2.凍融破碎法(freezing and thawing)
將細胞放在低溫下冷凍(約-15℃),然后在室溫中融化,反復多次而達到破壁作用。由于冷凍,一方面能使細胞膜的疏水鍵結構破裂,從而增加細胞的親水性能,另一方面胞內水結晶,形成冰晶粒,引起細胞膨脹而破裂。對于細胞壁較脆弱的菌體,可采用此法。
3.酶溶破碎法(enzyme lysis)
酶解是利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞,使細胞壁受到部分或破壞后,再利用滲透壓沖擊等方法破壞細胞膜,進一步增大胞內產物的通透性。溶菌酶(lysozyme)適用于革蘭氏陰性菌細胞的分解,應用于革蘭氏陽性菌時,需輔以EDTA使之更有效地作用于細胞壁。 真核細胞的細胞壁不同于原核細胞,需采用不同的酶。
4.化學破碎法(chemical treatment)
采用化學法處理可以溶解細胞或抽提胞內組分。常用酸、堿、表面活性劑和有機溶劑等化學試劑
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