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牛結核血清抗體操作步驟

閱讀次數:1248   發布時間:2013/5/13 10:59:12

操作方法

    1.膠體金的制備  試驗用水均要求三蒸餾水并過去離子柱,*終去離子水的電阻大于100萬Ω。所有容器*終均用去離子水清洗。
   (1)采用鞣酸—枸櫞酸鈉還原法制備
   A液  1%HAuCl4                   2.00ml
        去離子水                    158.00ml
   B液  1%枸櫞酸鈉                 8.00ml
        0.1%Mol/L K2CO3            0.20ml
        1%鞣酸                     0.20ml
        去離子水                    31.60ml
   將A液和B液分別于60℃水浴30min,并不時攪拌,迅速將B液加入至A液中,攪拌,顏色為深藍色,繼續加熱至100℃,5 min~10min,溶液顏色變為深紅色,自然冷卻后4℃保存。
   (2)膠體金鑒定:外觀呈深紅色、晶瑩透亮,迎著日光可見有光帶。電鏡觀察膠體金粒子大小平均為10nm,顆粒大小一致,分布均勻。
    2.膠體金與兔抗牛IgG用量比例的確定  每ml膠體金所需的穩定蛋白量是30µg,根據試劑用量增加20%,所以每ml膠體金所需的穩定兔抗牛IgG量為36µg。
    3.金標記兔抗牛IgG的制備  取所需量的兔抗牛IgG,加入少許去離子水,用0.1Mol/L K2CO3溶液調pH值為9.0(用精密pH試紙測定),同時膠體金溶液的pH值也調至9.0。在磁力攪拌下,將20ml膠體金溶液加入至兔抗牛IgG中,繼續攪拌10min,加入3.5ml 3%的聚乙二醇(分子量20 000)作為穩定劑,以使其*終濃度達到0.05%,再攪拌15min后,置4℃冰箱保存備用。
    4.金標兔抗牛IgG的純化  將金標記的兔抗牛IgG以2 500r/min離心15min,以除去膠體金的聚合物,取上清以65 000g離心1h,可見離心物分為三層,上層為淡黃色,含有未結合的兔抗牛IgG,下層為近黑色,是尚未結合的膠體金顆粒,*主要的中間層為紅色,是結合良好的金標記的兔抗牛IgG,傾去上層,收集中層液,用含0.1%BSA的0.01Mol/L pH8.2PB混合至原體積的1/10,過濾除菌,分裝,4℃保存備用。
    5.金標記兔抗牛IgG的鑒定
   (1)顆粒大小及均勻度鑒定:取少許金標記的兔抗牛IgG,負染,電鏡觀察顆粒大小及均勻度,并測量粒子直徑大小。
   (2)活性鑒定:將牛IgG點樣于硝酸纖維膜上,直接加金標兔抗牛IgG抗體,應顯示出明顯的粉紅色斑點。
    6.正式試驗程序
   (1)點樣  以打孔器將微孔濾膜制成直徑3mm的膜片。將牛結核PPD用0.01Mol/LpH9.0PBS液稀釋為40µg/ml,用微量加樣器加1µl抗原于膜片中央,37℃烘干10min。
   (2)封閉  將膜片置于0.01Mol/L pH7.4含0.2%BSA的PBST液中,37℃作用45min,其間振蕩數次。取出后以蒸餾水洗滌1次,用濾紙吸干。
   (3)加待檢血清  待檢血清以PBST液做1︰160倍稀釋。將膜片浸入其中,37℃作用1h,其間振蕩數次。取出后,以PBST液洗滌后,濾紙吸干。此步同時設標準陽性血清和陰性血清對照。
   (4)加金標抗體  以PBST液將金標液作1︰10稀釋,將膜片浸入其中,37℃作用2h,中間振蕩數次。
   (5)銀染  將膜片從金標液中取出,于去離子水洗滌3次,每次3min。然后將膜片浸入暗室中的銀染色液中,室溫下作用10min,移入定影液中,室溫作用5min。然后用去離子水沖洗,自然干燥后觀察結果。

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